甲基化的甲基化检测方法
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发布时间：2022-04-23 03:23
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热心网友
时间：2023-07-14 08:34
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的*。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育*密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。
1、甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
2、亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
3、高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）
在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。
其中，样品要求：细胞（≥106 个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。
热心网友
时间：2023-07-14 08:35
Septin9肿瘤基因甲基化检测技术，是由德国EIP公司（Epigenomics）研发的一项基于基因靶点是否出现甲基化表达变化的肿瘤超早期检测技术，该技术在与欧洲多家权威医疗机构进行临床试验后，获得了欧盟CE认证，在欧洲被广泛运用到肿瘤的超早期筛查和临床诊断中。之后德国EIP公司将技术授权给美国博尔诚公司（BioChain Institute Inc.）共同开发针对结直肠癌、胃癌、肝癌、食管癌、肺癌等癌症种类的检测试剂，并且与美国德州大学MD安德森癌症中心（UT MDAndersonCancerCenter）共同进行临床试验，在美获得了美国药监局FDA认证，该项技术于2016年被列入了美国疾病预防工作委员会（USPSTF）的筛查项目指南中，作为美国40岁以上人群的常规癌症超早期筛查项目之一。2014年美国博尔诚进入中国后，在北京成立博尔诚医学检验公司，与国内几十家顶级医院（北京协和、北京301、复旦大学附属肿瘤医院、四川大学华西医院、西安西京医院、中日友好医院.....）进行临床合作试验，并于2015年8月获得国家食药监局CFDA认证，目前该项目已进入到国内多家顶级三甲医院中（北京301医院、四川省人民医院、西安西京医院、中日友好医院、中南大学湘雅医院等），被运用于癌症超早期以及早期的筛查，具有重要的临床诊断学意义。
